分子标记的概念有 孟目的 和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的 脱氧核糖核酸 序列或 蛋白质 。狭义分子标记是指能反映生物个体或 种群 间 基因组 中某种差异的特异性DNA片段。分子标记（Molecular Markers），是以个体间 遗传物质 内 核苷酸 序列变异为基础的 遗传标记 ，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。分子标记用于遗传图谱构建是 遗传学 领域的重大进展之一。分子标记广泛存在于基因组的各个区域，通过对随机分布于整个基因组的分子标记的多态性进行比较，就能够全面评估研究对象的多样性，并揭示其遗传本质。
概念
与其他几种遗传标记——形态学标记、 生物化学 标记、细胞学标记相比， 脱氧核糖核酸 分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为 共显性 ，对隐性的 性状 的选择十分便利； 基因组 变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的 脱氧核糖核酸 都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、 基因库 构建、基因 克隆 等方面。
理想要求
理想的分子标记必须达以下几个要求：⑴ 具有高的多态性；⑵ 共显性 遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合 基因型 ；⑶ 能明确辨别 等位基因 ；⑷ 遍布整个 基因组 ；⑸ 除特殊位点的标记外，要求分子标记 均匀分布 于整个基因组；⑹ 选择中性（即无基因多效性）；⑺ 检测手段简单、快速（如实验程序易自动化）；⑻ 开发成本和使用成本尽量低廉；⑼ 在实验室内和实验室间重复性好（便于 数据交换 ）。但是，发现的任何一种分子标记均通过 电泳 分离不同的生物 脱氧核糖核酸 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针 与之进行杂交，通过放射自显影或非 同位素 显色技术来揭示 DNA 的多态性。
(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）
1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性（RFLP）技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代 遗传标记 。RFLP基本原理：利用特定的限制性 内切酶 识别并切割不同生物个体的 基因组 脱氧核糖核酸 ，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了 DNA分子 上不同酶切位点的分布情况。通过 凝胶电泳 分析这些片段，就形成不同带，然后与 克隆 DNA 探针 进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组 脱氧核糖核酸 在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的 等位基因 之间 碱基 的替换、重排、缺失等变化导致限制 内切酶 识别和酶切发生改变从而造成 基因型 间限制性片段长度的差异。
RFLP的等位基因其有 共显性 特点。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是 克隆 可表现 基因组 脱氧核糖核酸 多态性的 探针 较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高。自RFLP问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。
②数目可变 串联重复 多态性
(Variable Number of Tandem Repeats，VNTR）
数目可变串联重复序列又称 小卫星 DNA (Minisatellite DNA），是一种重复DNA小序列，为10到几百 核苷酸 ，拷贝数10一10001不等。VNTR基本原理与RFLP大致相同，只是对限制性 内切酶 和 脱氧核糖核酸 探针 有特殊要求：⑴限制性内切酶的酶切位点必须不在 重复序列 中，以保证 小卫星 或微卫星序列的完整性。⑵内切酶在 基因组 的其他部位有较多酶切位点，则可使 卫星 序列所在片段含有较少无关序列，通过 电泳 可充分显示不同长度重复序列片段的多态性。⑶分子杂交所用DNA探针核昔酸序列必须是 小卫星 序列或微卫星序列，通过分子杂交和放射自显影后，就可一次性检测到众多小卫星或微卫星位点，得到个体特异性的DNA 指纹 图谱。
小卫星标记的多态信息含量较高，在17一19之间。缺点是数量有限，而且在基因组上分布不均匀，这就极大限制其在基因定位中的应用。VNTR也存在实验操作繁琐、检测时间长、成本高的缺点。
标记技术
随机 引物 的PCR标记
所用引物的 核苷酸 序列是随机的，其扩增的 脱氧核糖核酸 区域事先未知。随机引物PCR扩增的 DNA 区段产生多态性的分子基础是模板 DNA 扩增区段上引物结合位点的 碱基 序列的突变，不同来源的 基因组 在该区段上表现为扩增产物有无差异或扩增片段大小的差异。随机引物PCR标记表现为显性或 共显性 。
①随机扩增多态性DNA
(Random amplified Polymorphism DNA，RAPD)
RAPD技术是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技术发展的检测 脱氧核糖核酸 多态性的方法。基本原理：它是利用随机 引物 （一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增 脱氧核糖核酸 片段，然后用 凝胶电泳 分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了 基因组 相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插人、缺失或 碱基 突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。就单一 引物 而言，其只能检测基因组特定区域 脱氧核糖核酸 多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组 指纹 图谱。
与RFLP相比，RAPD具有以下优点：⑴技术简单，检测速度快；⑵ RAPD分析只需少量 脱氧核糖核酸 样品；⑶不依赖于种属特异性和 基因组 结构，一套引物可用于不同生物基因组分析；⑷成本较低。但RAPD也存在一些缺点：⑴ RAPD标记是一个显性标记，不能鉴别 杂合子 和 纯合子 ；⑵存在共迁移问题， 凝胶电泳 只能分开不同长度 脱氧核糖核酸 片段，而不能分开那些分子量相同但 碱基 序列组成不同的DNA片段；⑶ RAPD技术中影响因素很多，所以实验的稳定性和重复性差。
②任意 引物 PCR
(Arbitrarily Primed 聚合酶 Chain Reaction，AP—PCR）
在AP—PCR分析中，所使用的引物较长（10－50 bp) ， PCR反应分为两个阶段，首先 寡聚核苷酸 引物在低严谨条件下与模板 脱氧核糖核酸 退火 ，此时发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互作用。然后进行高严谨退火条件的循环，两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件下扩增。采用 变性 聚丙烯 酞胺 凝胶电泳 分析PCR产物，最终反应结果与RAPD类似。只要设计的 引物 在低严谨退火条件下能减少引物产生人为产物，应用成对组合的引物可以产生新的AP—PCR谱带，但引物 联会 组合使用时，得到的图谱与单引物单独使用时产生的图谱之和很不相同，这样，50个引物能产生1250种不同 指纹 图谱。
AP—PCR方法不需预知序列资料，而且检测的 基因组 样本是任意的，还能够用于检测近等基因系（或同类系）中的多态性。AP—PCR的缺点是每个新的多态性都必须经纯化才能进一步使用。另外，此方法在 杂合子 中仅可辨别长度多态性。
③ 脱氧核糖核酸 扩增指纹印迹
(DNA Amplification Fingerprinting， DAF )
DAF是一种改进的RAPD分析技术，与RAPD技术不同的是，DAF分析中所使用的 引物 浓度更高，长度更短（一般为5一8 bp），因此它所提供的谱带信息比RAPD大得多，如当使用5个核昔酸的引物时，引物和模板的组合大约可扩增出10一100个DNA片段。PCR扩增产物是在 凝胶 上进行分离，通过银染即可产生非常复杂带型。
特异引物的PCR标记
特异引物的PCR标记所用引物是针对已知序列的 脱氧核糖核酸 区段而设计的，具有特定 核苷酸 序列（通常为 18—24 bp），可在常规PCR 退火 温度下进行扩增，对 基因组 DNA 的特定区域进行多态性分析。
①序列标志位点
( 序列 Tagged Sites，STS)
STS是对以特定对 引物 序进行PCR特异扩增的一类分子标记的统称。通过设计特定的引物，使其与基因组DNA序列中特定结合位点结合，从而可用来扩增基因组中特定区域，分析其多态性。利用特异PCR技术的最大优点是它产生信息非常可靠，而不像RFLP和RAPD那样存在某种模糊性。
②简单 重复序列
(Simple Sequence Repeat，SSR)
简单重复序（SSR）也称微卫星DNA，其 串联重复 的核心序列为1一6 bp，其中最常见是双 核苷酸 重复，即（CA) n和（TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10一60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计 引物 ，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行 凝胶电泳 ，根据分离片段的大小决定 基因型 并计算 等位基因频率 。
SSR具有以下一些优点：（l）一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；⑵微卫星呈 共显性 遗传，故可鉴别 杂合子 和 纯合子 ；⑶所需 脱氧核糖核酸 量少。显然，在采用SSR 技术分析 微卫星DNA多态性时必须知道 重复序列 两端的DNA序列的信息。如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。
③序列特异性扩增区
( 序列 —characterized amplified Region，SCAR）
SCAR突击步枪 标记是在RAPD技术基础上发展起来的。SCAR标记是将目标 RAPD 片段进行 克隆 并对其末端测序，根据 RAPD 片段两端序列设计特异 引物 ，对基因 脱氧核糖核酸 片段再进行PCR特异扩增，把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。SCAR标记是显性遗传，待检 脱氧核糖核酸 间的差异可直接通过有无扩增产物来显示。SCAR标记方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。
④单引物扩增反应
(Single 底火 Amplification Reaction， SPAR )
SPAR技术是与RAPD技术相似的一种标记技术，SPAR也只用一个 引物 ，但所用的引物是在SSR的基础上设计的。这些引物能与SSR之间的间隔序列进行特异性结合，然后通过PCR技术扩增SSR之间的 脱氧核糖核酸 序列， 凝胶电泳 分离扩增产物，分析其多态性。另外，还有一种与SPAR技术非常相似的标记技术，即ISTR (Inverse 序列 —tagged Repeat）技术，ISTR所用的引物是在 反向重复序列 基础上设计的，PCR扩增的是反向重复序列之间的DⅣA序列。
(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)
SSCP是指等长的 单链DNA 因核昔酸序列的差异而产生构象变异，在非 变性 聚丙烯 酞胺中的表现为 电泳 迁移率的差别。单链 脱氧核糖核酸 构象分析对DNA序列的改变非常敏感，常常一个 碱基 差别都能显示出来。在SSCP分析中，利用PCR技术定点扩增 基因组 DNA中某一目的片段，将扩增产物进行变性处理， 双链DNA 分开成单链，再用非变性聚丙烯酞胺 凝胶电泳 分离，根据条带位置变化来判断目的片段中是否存在突变。SSCP结果判定是通过多个样品之间对比，观察条带之间位置改变，从而显示出不同生物个体的 脱氧核糖核酸 特异性，达到 指纹 分析目的。为了进一步提高SSCP的检出率，可将SSCP分析与其它突变检测方法相结合。其中与杂交双链分析（Heterocluplex analysis，Het）法结合可以大大提高检出率。Het法是用 探针 与要检测的 单链DNA 或 核糖核酸 进行杂交，含有一对 核苷酸碱基对 错配的杂交链可以和完全互补的杂交链在非 变性 PAG 凝胶 上通过 电泳 被分离开。对同一靶序列分别进行SSCP和Het分析可以使 点突变 的检出率接近100%，而且实验简便。
⑥双脱氧化 指纹 法
(Dideoxy Fingerprints，ddF)
ddF是将双脱氧末端终止测序法与SSCP结合起来的分析技术，对由双脱氧末端终止的长短不一的单链DNA进行SSCP分析。如果目的片段存在一个突变，则所有大于某一大小对应于突主变位置的双脱氧终止片段无野生型系统，对于每一个突有多次机会检测其迁移率改变，提高了检测突变的效率。ddF方法克服了SSCP分析时因 脱氧核糖核酸 长度影响SSCP显示的困难，通过一种双脱氧核昔酸生产特异性的 单链DNA ，使其中长度合适的DNA片段显示SSCP改变。
DNA标记
①扩增片段长度多态性
( amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)
AFLP是1995年 荷兰 科学家Zabeau和Vos等发展起来的一种检测DNA多态性的新方法，文章发表于Nucleic Acids Research。AFLP 是 RFLP 与PCR相结合的产物，其基本原理是先利用限制性 内切酶 水解 基因组 脱氧核糖核酸 产生不同大小的 DNA 片段，再使双链人工接头的酶切片段相边接，作为扩增反应的模板 DNA，然后以人工接头的互补链为 引物 进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加 1—3个选择性 核苷酸 作引物对模板 DNA 基因再进行选择性扩增，通过 聚丙烯酰胺 凝胶电泳 分离检测获得的 脱氧核糖核酸 扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。引物由三部分组成：与人工接头互补的核心 碱基 序列、限制性内切酶 识别序列 、引物3’端的选择碱基序列（1—10 bp）。接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列为结合位点。该技术的独特之处在于所用的专用引物可在知道 脱氧核糖核酸 信息的前提下就可对酶切片段进行PCR 扩增。为使酶切浓度大小分布均匀，一般采用两个限制性 内切酶 ，一个酶为多 切点 ，另一个酶切点数较少，因而 AFLP 分析产生的主要是由两个酶共同酶切的片段。AFLP 结合了 RFLP 和 RAPD两种技术的优点，具有 分辨率 高、稳定性好、效率高的优点。但它的技术费用昂贵，对 脱氧核糖核酸 的纯度和内切酶的质量要求很高。尽管 AFLP 技术诞生时间较短，但可称之为分子标记技术的又一次重大突破，被认为是一种十分理想、有效的分子标记。
②酶切扩增多态性序列
(Cleaved amplified Polymorphism Sequences，CAPS）
CAPS技术又称为PCR—RFLP，它实质上是PCR技术与RFLP技术结合的一种方法。CAPS的基本原理是利用己知位点的 脱氧核糖核酸 序列资源设计出一套特异性的PCR 引物 （19—27bp），然后用这些引物扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一种专一性的限制性 内切酶 切割所得扩增产物， 凝胶电泳 分离酶切片段，染色并进行RFLP分析。CAPS标记揭示的是特异PCR片段的限制性长度变异的信息。CAPS是一类 共显性 分子标记，其优点是避免了RFLP分析中膜转印这一步骤，又能保持RFLP分析的精确度。另外，由于很多限制性内切酶均可与扩增 脱氧核糖核酸 酶切，所以检测到多态性机会较大。
DNA芯片
核苷酸 多态性(Single 核苷酸 Polymorphism， SNP )
SNP标记是美国学者Lander E于1996年提出的第三代 脱氧核糖核酸 遗传标记 。SNP是指同一位点的不同 等位基因 之间仅有个别 核苷酸 的差异或只有小的插入、缺失等。从分子水平上对单个核 酸的差异进行检测，SNP 标记可帮助区分两个个体 遗传物质 的差异。 人类基因组 大约每 1250 bp SNP 出现一次，已有2000多个标记定位于人类 染色体 ，对人类 基因组学 研究具有重要意义。检测 SNP 的最佳方法是 DNA 芯片技术。SNP 被称为第三代 DNA 分子标记技术，随着 DNA 芯片技术的发展，其有望成为最重要最有效的分子标记技术。
遗传标记
基因型 的特殊的易于识别的表现形式。其最基本的两个特性是：
可遗传性。
可识别性（多态性）。
遗传标记是研究遗传现象和物种进化的不可缺少的工具。
应用领域
基因组 作图和基因定位研究
长期以来，各种生物的遗传图谱几乎都是根据诸如形态、生理和生化等常规标记来构建的，所建成的遗传图谱仅限少数种类的生物，而且图谱 分辨率 大多很低，图距大，饱和度低，因而应用价值有限。分子标记用于遗传图谱构建是 遗传学 领域的重大进展之一。随着新的标记技术的发展，生物遗传图谱名单上的新成员将不断增加，图谱上标记的密度也将越来越高。建立起完整的高密度的分子图谱，就可以定位感兴趣的基因。
基于图谱 克隆 基因
图位克隆(Map—bascd cloning））是近几年随着分子标记遗传图谱的相继建立和基因分子定位而发展起来的一种新的基因克隆技术。利用分子标记辅助的图位克隆无需事先知道基因的序列，也不必了解基因的表达产物，就可以直接克隆基因。图位克隆是最为通用的基因识别途径，至少在理论上适用于一切基因。 基因组 研究提供的高密度遗传图谱、大尺寸物理图谱、大片段基因组文库和基因组全序列，已为图位克隆的广泛应用铺平了道路。
物种亲缘关系和系统分类中的应用
分子标记广泛存在于基因组的各个区域，利用 遗传多样性 的结果可以对物种进行 聚类分析 ，进而了解其系统发育与亲缘关系。分子标记的发展为研究物种亲缘关系和系统分类提供了有力的手段。
用于疾病诊断和遗传病连锁分析
1980年，Bostein等成功的将PFLP技术用于镰刀型贫血症的诊断分析，开创了基因诊断的先河。PFLP是以 格雷戈尔·孟德尔 方式遗传，因此可以作为染色体上致病基因座位的遗传标志。许多与相连锁的致病基因得以定位。 小卫星 和微卫星因其高度多态性而被广泛用于疾病诊断和遗传病的连锁分析。随着高通量SNP检测技术方法的出现，作为数量最多且易于批量检测的多态标记，SNP在连锁分析与基因定位，包括复杂疾病的基因定位、关联分析、个体和群体对环境致病因子与药物的易感性研究 中将 发挥愈来愈重要的作用。