同源重组

生物学名词之一

同源 重组(英文名: 人属 logous 基因重组 ) 指发生在非姐妹染色 单体 (sister chromatin) 之间或同一 染色体 上含有同源序列的 脱氧核糖核酸 分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的 蛋白质 催化 ,如 原核生物 细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等,以及 真核生物 细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。

同源重组是生命体的基本生物事件,是 遗传物质 DNA代谢(DNA复制,重组,修复)的三种主要途径之一。它在 细胞 生长、 减数分裂 、 配子 形成、物种进化、DNA双链断裂修复、 基因组 稳定性维持等多方面,都起着必需作用。同时,如果同源重组缺陷,将导致基因组极其不稳定,并引起各种疾病,包括癌症。利用同源重组技术,可以进行动植物物种改造,也可以进行疾病的基因治疗。所以,阐明同源重组的分子机制,不仅推进对生命现象的理解,也为提高人类的健康服务。

简介

同源重组反应严格依赖 脱氧核糖核酸 分子 之间的同源性,100%重组的DNA分子之间的重组常见于非姐妹 染色体 之间的同源重组,称为 人属 logous 基因重组 ,而小于100%同源性的DNA分子之间或分子之内的重组,则被称为Hemologus Recombination。后者可被负责碱基错 联会 的蛋白如 原核生物 细胞内的MutS 或 真核生物 细胞内的MSH2-3等 蛋白质 “编辑”。

同源重组可以双向交换 DNA 分子 ,也可以单向转移DNA分子,后者又被称为 基因转换 (Gene Conversion)。由于同源重组严格依赖分子之间的同源性,因此, 原核生物 的同源重组通常发生在 脱氧核糖核酸 复制过程中,而真核生物的同源重组则常见于 细胞周期 的S期之后。

基因敲除

定义

基因敲除(geneknockout),是指对一个结构已知但功能未知的基因,从分子水平上设计实验,将该基因去除,或用其它顺序相近基因取代,然后从整体观察实验动物,推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。

基因敲除除可中止某一基因的表达外,还包括引入新基因及引入 定点突变 。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因,也可以用正常基因敲除相应的突变基因。

技术路线

基因敲除是80年代后半期应用 脱氧核糖核酸 同源重组原理发展起来的一门新技术。80年代初, 胚胎干细胞 (ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年,首次证实的 哺乳动物 细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年,Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的 小鼠 模型。此后的几年中,基因敲除技术得到了进一步的发展和完善。

基因敲除的技术路线如下:

(1)构建重组基因载体﹔

(2)用电穿孔、显微注射等方法把重组 脱氧核糖核酸 转入受体 细胞核 内﹔

(3)用选择 培养基 筛选已击中的 细胞 ﹔

(4)将击中细胞转入 胚胎 使其生长成为 转基因动物 ,对转基因动物进行形态观察及 分子生物学 检测。

基因敲除的靶细胞目前最常用的是小鼠ES细胞。基因敲除的 技术路线 虽不复杂,但由于高等 真核生物 内外源 DNA 与靶细胞DNA序列自然发生同源重组的机率非常低,约为百万分之一,要把基因敲除成功的细胞筛选出来是一件非常困难的工作。因此,同源重组的筛选和检测就成了基因敲除技术所要解决的关键问题。目前已有多种筛选方法,其中1988年犹它大学的Capecchi教授的研究组发展的"正负双向选择系统"适用范围宽且效率较高。

转移法

同源 重组( 人属 logous 基因重组 )是将外源基因定位导入受体 细胞 染色体 上的方法,因为在该座位有与导入基因同源的序列,通过单一或双交换,新基因片段可替换有缺陷的基因片段,达到修正缺陷基因的目的。 位点特异性重组 是发生在两条 脱氧核糖核酸 链特异位点上的重组,重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点;attachmentsite,att)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与 催化 。重组酶仅能催化特异性位点间的重组,因而重组具有特异性和高度保守性。

根据氨基酸序列相似性和催化机制的差异,位点特异性重组酶主要分为两大家族,即整合酶系和解离酶/转化酶系,这两个家族相隔很远。整合酶家族催化重组的机制是进行 酪氨酸 介导的链交换,该家族包含有Cre/loxP、FLP/FRT等已经研究得比较清楚并广泛应用的重组酶系统。 离解 酶/转化酶家族催化机制是由 丝氨酸 介导的,当酶和 脱氧核糖核酸 之间形成含磷的丝氨酸连接时,连接处DNA的4条链发生协调的交错断裂,然后重新结合,完成同源重组。该家族成员包括来自于 链霉菌属 噬菌体 的φC31整合酶、lactococcal噬菌体的TP901—1整合酶、 放射菌 噬菌体的R4整合酶等。中C31整合酶(φC31—int)能够有效介导噬菌体 基因组 中attP位点与细菌 宿主 染色体 上attB位点间的重组反应,将外源基因整合到基因组中,使转基因的持续、高效表达,为非 病毒载体 转移系统在遗传病基因治疗的应用开辟了新的途径。

DNA

日本理化研究所发表新闻公报说,该所研究人员发现酵母线粒体中的DNA( 脱氧核糖核酸 )在一定条件下进行同源重组时,不像以前认为的那样需要DNA形成 超螺旋 。这一发现将为抗衰老等方面的 生物医学 研究提供新线索。

新闻公报说,记录生命遗传信息的 DNA 呈稳定的双链 尾旋 结构,但在复制、 转录 和重组等过程中,DNA链会出现一种超螺旋现象,这类似于螺旋状的电话线在受到外力时可能出现复杂的螺旋状态。

理化研究所的凌枫和柴田武彦等研究人员在酵母线粒体 脱氧核糖核酸 的同源重组实验中,使用经过高度纯化的酶“Mhr1”进行 催化 ,发现这种条件下的DNA同源重组不需要形成超螺旋,而是通过一种名为“三链体”的中间体进行。

凌枫对记者说,曾有研究证明“Mhr1”酶在抑制 线粒体 异质性上发挥着关键作用,此次研究揭示了其催化的反应机制核心。由于线粒体异质性与衰老等生理过程密切相关, 物理化学 研究所的这项研究为抗衰老等方面的 生物医学 研究提供了新线索。

参考资料

  1. 结核分枝杆菌分子遗传工具及方法介绍 上海晶诺生物科技有限公司 2024-03-08
  2. Cell:孔道春团队揭示DNA同源重组的关键机制 | Cell Press对话科学家 Cell Press 2024-03-10